賽默飛分光光度計(jì) NanoDrop Eight 檢測步驟

一、儀器概述

NanoDrop Eight 是賽默飛（Thermo Fisher Scientific）開發(fā)的一款多通道微量分光光度計(jì)，能夠同時(shí)檢測多達(dá) 8 個(gè)樣品，適合核酸、蛋白質(zhì)和寡核苷酸等樣品的定量與純度分析。其核心優(yōu)勢是微量樣品檢測（僅需 1–2 μL）、高通量、多模式選擇以及快速出結(jié)果。相比傳統(tǒng)比色皿分光光度計(jì)，它更加節(jié)約樣本和耗材，檢測效率顯著提升。

為了獲得可靠的檢測數(shù)據(jù)，正確掌握 NanoDrop Eight 的檢測步驟尤為重要。

二、檢測前準(zhǔn)備

1. 儀器狀態(tài)檢查

• 開機(jī)后檢查主機(jī)和檢測平臺(tái)是否清潔。

• 確認(rèn)光學(xué)窗口無灰塵、水漬或殘留物。

• 檢查電源是否穩(wěn)定，避免在電壓波動(dòng)環(huán)境下運(yùn)行。

2. 光源與系統(tǒng)預(yù)熱

• NanoDrop Eight 采用氘燈與鎢燈組合光源，開機(jī)后需等待數(shù)分鐘，以保證光源穩(wěn)定。

• 預(yù)熱時(shí)間通常為 5–10 分鐘，不宜過短。

3. 軟件與方法選擇

• 啟動(dòng)配套軟件，根據(jù)實(shí)驗(yàn)類型選擇檢測模式（核酸、蛋白質(zhì)、寡核苷酸或自定義方法）。

• 若為定量實(shí)驗(yàn)，可預(yù)先設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)。

三、樣本制備要求

1. 體積要求

• 每個(gè)通道需 1–2 μL 樣本。

• 若體積不足，可能無法形成完整液滴，導(dǎo)致檢測失敗。

2. 濃度范圍

• DNA：2–15,000 ng/μL

• RNA：2–5,000 ng/μL

• 寡核苷酸：2–5,000 ng/μL

• 蛋白質(zhì)（A280 法）：0.1–100 mg/mL

3. 純度要求

• 核酸 A260/A280 比值應(yīng)在 1.8–2.0 之間。

• RNA A260/A280 理想值為 2.0 左右。

• 蛋白質(zhì)檢測緩沖液需避免在 280 nm 附近有強(qiáng)吸收。

4. 樣品處理

• 確保溶液澄清，無沉淀或顆粒。

• 檢測前充分混勻，避免濃度分層。

• 對(duì) RNA 樣本需使用 RNase-free 器材，避免降解。

四、檢測步驟

步驟一：平臺(tái)清潔

• 用無絨紙或?qū)Ｓ貌潦貌颊喝ルx子水，清潔檢測平臺(tái)。

• 確保光學(xué)窗口表面無塵粒和殘液。

步驟二：空白參比

• 在檢測平臺(tái)上加 1–2 μL 對(duì)照緩沖液，關(guān)閉壓桿進(jìn)行檢測。

• 軟件會(huì)自動(dòng)記錄參比值，作為后續(xù)樣本計(jì)算的基線。

步驟三：加載樣品

• 將待測樣本移取 1–2 μL 加至檢測平臺(tái)。

• 確保樣本液滴覆蓋光學(xué)窗口，無氣泡。

• 加樣順序應(yīng)保持一致，避免交叉污染。

步驟四：檢測運(yùn)行

• 關(guān)閉壓桿，軟件開始自動(dòng)檢測。

• 檢測過程僅需數(shù)秒，結(jié)果將實(shí)時(shí)顯示在界面上。

步驟五：數(shù)據(jù)記錄

• 系統(tǒng)會(huì)顯示濃度值、A260/A280 比值、A260/A230 比值及完整光譜曲線。

• 用戶可選擇導(dǎo)出數(shù)據(jù)或直接生成檢測報(bào)告。

步驟六：平臺(tái)清潔

• 每次樣本檢測后，應(yīng)立即用去離子水清洗光學(xué)窗口。

• 避免殘留物干燥附著在檢測平臺(tái)上。

五、數(shù)據(jù)處理與結(jié)果解讀

1. 核酸檢測

• DNA 濃度換算：A260 = 1.0 時(shí)，約等于 50 μg/mL。

• RNA 濃度換算：A260 = 1.0 時(shí)，約等于 40 μg/mL。

• 純度判斷：

• A260/A280 = 1.8–2.0 表示核酸純度較好。

• A260/A230 = 2.0–2.2 表示基本無有機(jī)污染。

2. 蛋白質(zhì)檢測

• A280 法：適合純化蛋白。

• 染料法：如 Bradford 法，需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

• 純度判斷：若緩沖液有吸收干擾，應(yīng)結(jié)合對(duì)照樣本進(jìn)行扣除。

3. 多通道結(jié)果管理

• 軟件支持同時(shí)顯示 8 個(gè)樣本的檢測結(jié)果。

• 可批量導(dǎo)出為 Excel 或 PDF 文件，便于保存與分析。

六、實(shí)驗(yàn)優(yōu)化建議

1. 樣品優(yōu)化

• 高濃度樣本應(yīng)稀釋后檢測，以保持在儀器線性范圍內(nèi)。

• 對(duì) RNA 樣本，可加入保護(hù)劑以提高穩(wěn)定性。

2. 操作優(yōu)化

• 避免樣本帶入氣泡，否則會(huì)影響光路。

• 檢測順序從低濃度到高濃度，減少交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。

3. 數(shù)據(jù)優(yōu)化

• 對(duì)重要實(shí)驗(yàn)，建議同時(shí)保存濃度值和光譜曲線。

• 對(duì)染料法實(shí)驗(yàn)，應(yīng)使用同一批次試劑，避免批次差異。

七、常見問題及解決

1. 檢測無結(jié)果或數(shù)值過低

• 可能原因：樣本濃度過低或體積不足。

• 解決方法：增加樣品濃度，確保加樣體積足夠。

1. 吸光度過高

• 可能原因：樣本濃度超出檢測范圍。

• 解決方法：進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

1. 重復(fù)性差

• 可能原因：樣本未混勻或平臺(tái)未清潔。

• 解決方法：混勻后再檢測，每次檢測后及時(shí)清潔平臺(tái)。

1. A260/A280 比值異常

• 可能原因：核酸樣品中含蛋白質(zhì)或酚。

• 解決方法：進(jìn)一步純化樣品。

八、實(shí)驗(yàn)室管理與規(guī)范化操作

• 建立 SOP：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定 NanoDrop Eight 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

• 人員培訓(xùn)：所有使用人員需接受培訓(xùn)，熟悉操作流程。

• 使用記錄：每次檢測應(yīng)記錄樣品編號(hào)、檢測時(shí)間和濃度值。

• 維護(hù)保養(yǎng)：定期進(jìn)行光學(xué)窗口檢查和軟件升級(jí)，確保長期穩(wěn)定運(yùn)行。

九、應(yīng)用場景說明

1. 分子克隆實(shí)驗(yàn)

• 快速檢測質(zhì)粒 DNA 濃度，保證下游實(shí)驗(yàn)成功。

1. 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

• 高通量 RNA 樣本檢測，提高測序前質(zhì)控效率。

1. 蛋白質(zhì)組學(xué)研究

• 多樣品并行檢測，提高蛋白質(zhì)定量的效率和準(zhǔn)確性。

1. 臨床與藥物開發(fā)

• 臨床樣品核酸檢測，藥物研發(fā)中蛋白質(zhì)濃度監(jiān)測。

十、總結(jié)

NanoDrop Eight 以其 微量樣本檢測、多通道高通量、操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確 的特點(diǎn)，為實(shí)驗(yàn)室核酸和蛋白質(zhì)的定量檢測提供了高效方案。通過規(guī)范的檢測步驟，包括 儀器準(zhǔn)備、樣本制備、空白參比、加樣檢測、數(shù)據(jù)處理和平臺(tái)清潔，用戶能夠獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化和規(guī)范化管理，可以最大限度發(fā)揮 NanoDrop Eight 的性能優(yōu)勢，提升實(shí)驗(yàn)室的工作效率與科研質(zhì)量。