賽默飛分光光度計(jì) NanoDrop Eight 樣本要求

一、概述

賽默飛 NanoDrop Eight 分光光度計(jì)是一款多通道微量紫外-可見光檢測儀器，廣泛用于高通量樣本定量，特別是在分子生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、臨床研究以及生物技術(shù)行業(yè)中。與傳統(tǒng)比色皿檢測相比，NanoDrop Eight 采用微量檢測平臺技術(shù)，僅需 1–2 μL 樣品 即可完成核酸、蛋白質(zhì)、寡核苷酸以及其他生物分子的定量和純度分析。

為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，研究者必須嚴(yán)格遵循樣本制備和檢測的相關(guān)要求。本文將系統(tǒng)總結(jié) NanoDrop Eight 在使用過程中對樣本的要求，包括樣本體積、濃度、純度以及不同實(shí)驗(yàn)場景下的特定注意事項(xiàng)。

二、適用樣本類型

NanoDrop Eight 支持多種生物樣本的光度檢測，主要包括：

1. 核酸樣本

• DNA（基因組 DNA、質(zhì)粒 DNA、PCR 產(chǎn)物等）

• RNA（總 RNA、mRNA、tRNA 等）

• 寡核苷酸（合成引物、探針等）

2. 蛋白質(zhì)樣本

• 純化蛋白

• 細(xì)胞裂解液中的粗提蛋白

• 常見蛋白濃度測定方法包括紫外吸收法（A280）和染料結(jié)合法（Bradford、BCA 等）。

3. 其他樣本

• 細(xì)胞或病毒裂解液

• 多肽溶液

• 一些特定的小分子化合物（只要在紫外-可見區(qū)有吸收峰）。

三、樣本制備要求

1. 樣本體積

• 每個(gè)檢測通道只需 1–2 μL 樣品。

• 過量樣品可能造成浪費(fèi)，而不足會導(dǎo)致檢測失敗。

2. 樣本濃度范圍

NanoDrop Eight 的線性檢測范圍較寬，但不同樣本類型有所區(qū)別：

• 雙鏈 DNA：2–15,000 ng/μL

• RNA：2–5,000 ng/μL

• 寡核苷酸：2–5,000 ng/μL

• 蛋白質(zhì)（A280 法）：0.1–100 mg/mL

• 蛋白質(zhì)（染料法）：靈敏度更高，可用于低濃度樣本

3. 樣本純度要求

• 核酸檢測需通過 A260/A280 比值和 A260/A230 比值來評估純度。

• A260/A280 在 1.8–2.0 之間表示核酸較純凈。

• A260/A230 在 2.0–2.2 之間表示基本無有機(jī)物或鹽類殘留。

• 蛋白質(zhì)檢測時(shí)，緩沖液中不應(yīng)含有在 280 nm 處有強(qiáng)吸收的成分。

• 任何沉淀或懸浮顆粒都會影響結(jié)果，應(yīng)先進(jìn)行離心或過濾。

4. 溶劑要求

• 常用溶劑包括去離子水、TE 緩沖液、PBS、Tris 緩沖液等。

• 溶劑必須與實(shí)驗(yàn)體系匹配，并作為“空白”參比。

四、核酸樣本的特定要求

1. DNA 樣本

• 樣本應(yīng)無明顯黏稠感，過高濃度的 DNA 溶液需稀釋。

• 樣品應(yīng)避免蛋白質(zhì)、酚或鹽污染，否則 A260/A280 和 A260/A230 比值會異常。

• 檢測前輕輕混勻，避免部分沉淀。

2. RNA 樣本

• RNA 樣品需避免降解，操作時(shí)應(yīng)使用 RNase-free 器材。

• RNA 質(zhì)量可通過 A260/A280 比值初步判斷，理想值約為 2.0。

• 若需進(jìn)一步確認(rèn)完整性，應(yīng)結(jié)合凝膠電泳或生物分析儀檢測。

3. 寡核苷酸樣本

• 合成的寡核苷酸需溶解均勻，避免局部沉淀。

• 在核酸定量中，ε（摩爾消光系數(shù)）需輸入正確，以保證計(jì)算準(zhǔn)確。

五、蛋白質(zhì)樣本的特定要求

1. 紫外吸收法（A280）

• 適用于含有色氨酸、酪氨酸殘基的蛋白。

• 要求樣品緩沖液在 280 nm 處無強(qiáng)吸收背景。

• 高鹽或表面活性劑會干擾測定，應(yīng)避免使用。

2. 染料結(jié)合法

• 常見有 Bradford 法、BCA 法。

• 適用于低濃度或無芳香族氨基酸殘基的蛋白。

• 需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確保定量準(zhǔn)確。

六、實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中的樣本注意事項(xiàng)

1. PCR 與分子克隆實(shí)驗(yàn)

• 核酸濃度過低可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，應(yīng)確保 DNA 在 10 ng/μL 以上。

• 質(zhì)粒 DNA 檢測應(yīng)排除 RNA 污染。

2. 轉(zhuǎn)錄組與測序?qū)嶒?yàn)

• RNA 樣品必須高純度，A260/A280 在 2.0 左右。

• RNA 應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3. 蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)

• 樣本緩沖液中避免含 SDS、Tris 等強(qiáng)吸收物質(zhì)。

• 對低濃度樣本，優(yōu)先選擇染料法。

4. 臨床與環(huán)境檢測

• 樣品來源復(fù)雜，必須進(jìn)行預(yù)處理以去除雜質(zhì)。

• 高鹽或有機(jī)溶劑會顯著影響檢測結(jié)果，應(yīng)進(jìn)行稀釋或純化。

七、常見問題與避免方法

1. 吸光度異常偏高

• 可能原因：比對液與樣本溶劑不一致。

• 避免方法：始終使用相同緩沖液作為空白。

1. 結(jié)果重復(fù)性差

• 可能原因：樣品未混勻，取樣不均。

• 避免方法：檢測前充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

1. A260/A280 比值偏離

• 可能原因：蛋白質(zhì)或酚類污染。

• 避免方法：重復(fù)提取或進(jìn)一步純化核酸。

1. 無讀數(shù)或讀數(shù)過低

• 可能原因：樣本濃度過低或體積不足。

• 避免方法：提高樣本濃度或檢查移液準(zhǔn)確性。

八、實(shí)驗(yàn)室規(guī)范化管理要求

• 樣本記錄：所有檢測樣本需建立記錄，包括濃度、體積、保存條件。

• 分批檢測：對于大批量樣品，應(yīng)統(tǒng)一條件，避免批間差異。

• 儀器清潔：檢測結(jié)束后用去離子水清洗檢測平臺，避免殘留污染。

• 人員培訓(xùn)：操作人員必須熟悉 NanoDrop Eight 的基本原理和樣本要求。

九、總結(jié)

賽默飛 NanoDrop Eight 分光光度計(jì)以其高通量、低樣本消耗和高精度的特點(diǎn)，已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的重要工具。為了獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必須嚴(yán)格遵循樣本體積、濃度、純度和緩沖液的要求，同時(shí)根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)場景調(diào)整樣本制備方法。通過掌握這些樣本要求，研究者不僅可以提升實(shí)驗(yàn)效率，還能顯著提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。