賽默飛分光光度計(jì)BioMate 160測量方法詳解

一、設(shè)備測量原理概述

賽默飛BioMate 160分光光度計(jì)是一款紫外-可見光譜分析儀，主要通過測定物質(zhì)對(duì)特定波長光的吸收或透射情況來推斷其濃度和結(jié)構(gòu)特征。其核心原理基于比爾-朗伯定律（Beer-Lambert Law）：

$$A=\epsilon ?c?l$$

其中：

• $A$ 為吸光度

• $\epsilon$ 為摩爾消光系數(shù)

• $c$ 為溶液濃度

• $l$ 為光程長度

BioMate 160采用氘燈（覆蓋紫外區(qū)）和鎢燈（覆蓋可見區(qū)），結(jié)合單色器選擇不同波長，檢測器則測量樣品對(duì)光的吸收強(qiáng)度。通過不同模式設(shè)定，可實(shí)現(xiàn)核酸定量、蛋白濃度測定、酶活性分析、溶液透光率測試等多種實(shí)驗(yàn)。

二、測量前的準(zhǔn)備工作

1. 設(shè)備檢查

• 確認(rèn)電源穩(wěn)定，預(yù)熱15~20分鐘，使光源穩(wěn)定。

• 檢查比色皿是否潔凈透明，無刮痕或氣泡。

• 打開操作界面，進(jìn)行系統(tǒng)自檢。

2. 參比校正

在所有實(shí)驗(yàn)前均需進(jìn)行空白對(duì)照測量：

• 使用與樣品相同的溶劑作為參比液。

• 在設(shè)定波長下調(diào)零，保證透過率為100%或吸光度為0。

3. 樣品準(zhǔn)備

• 確保樣品濃度在儀器檢測范圍內(nèi)，避免過高或過低。

• 樣品體積需足夠覆蓋光路，液面高于光束高度。

• 避免顆粒懸浮或沉淀，必要時(shí)進(jìn)行過濾或離心。

三、常用測量方法

1. 固定波長測量

最常見的模式，用于快速定量分析。

• 設(shè)置方法：輸入目標(biāo)波長（如260 nm或280 nm）。

• 應(yīng)用實(shí)例：核酸濃度檢測（A260），蛋白檢測（A280）。

• 優(yōu)點(diǎn)：操作簡單、快速。

2. 多波長測量

用于同時(shí)測定多個(gè)波長下的吸光度。

• 設(shè)置方法：設(shè)定2~10個(gè)波長（如260 nm、280 nm、230 nm）。

• 應(yīng)用實(shí)例：核酸純度分析（A260/A280、A260/A230比值）。

• 優(yōu)勢(shì)：一次檢測可獲得多參數(shù)結(jié)果。

3. 光譜掃描

獲取全波段吸收曲線。

• 設(shè)置方法：設(shè)定起始波長、終止波長及掃描間隔（如200~800 nm，1 nm間隔）。

• 應(yīng)用實(shí)例：化合物結(jié)構(gòu)研究、色素溶液吸收峰分析。

• 特點(diǎn)：適合未知樣品分析。

4. 動(dòng)力學(xué)測量

用于實(shí)時(shí)監(jiān)測吸光度隨時(shí)間的變化。

• 設(shè)置方法：設(shè)定波長（如340 nm），采樣間隔（如5秒），總時(shí)間（如10分鐘）。

• 應(yīng)用實(shí)例：酶促反應(yīng)速率測定，如NADH氧化檢測。

• 優(yōu)勢(shì)：能直接計(jì)算酶活性參數(shù)。

5. 定量分析（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）

利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立濃度-吸光度曲線，再測定未知樣品濃度。

• 步驟：

1. 配制一系列已知濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液

2. 在指定波長下測量吸光度

3. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸分析獲得方程

4. 測定未知樣品并代入計(jì)算

• 應(yīng)用實(shí)例：蛋白定量（Bradford、BCA法）、多酚含量測定。

6. 透過率測量

用于透明度、濁度或材料透光性研究。

• 設(shè)置方法：選擇%T模式，設(shè)定目標(biāo)波長。

• 應(yīng)用實(shí)例：水質(zhì)檢測、薄膜透光率測試。

四、應(yīng)用實(shí)例詳解

1. 核酸濃度與純度測定

• 波長：260 nm、280 nm、230 nm

• 判定標(biāo)準(zhǔn)：

• DNA純度：A260/A280 ≈ 1.8

• RNA純度：A260/A280 ≈ 2.0

• A260/A230值應(yīng)在2.0以上，過低提示有鹽或有機(jī)溶劑污染。

2. 蛋白濃度測定

• 直接法：A280測定，適合純化后的蛋白溶液。

• 間接法：Bradford法（595 nm）、BCA法（562 nm）。

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線：以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品。

3. 酶活性測定

• 實(shí)例：乳酸脫氫酶（LDH）檢測

• 波長：340 nm，檢測NADH吸光度下降

• 方法：設(shè)定動(dòng)力學(xué)模式，計(jì)算單位時(shí)間吸光度變化速率。

4. 藥物或化學(xué)品分析

• 對(duì)未知樣品進(jìn)行全波段掃描，尋找吸收峰。

• 結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品光譜進(jìn)行比對(duì)，推斷樣品成分。

5. 食品與環(huán)境檢測

• 食品色素分析：掃描200~600 nm，確定色素吸收峰。

• 水質(zhì)檢測：測定COD相關(guān)物質(zhì)在特定波長下的吸收強(qiáng)度。

五、數(shù)據(jù)處理與結(jié)果輸出

BioMate 160提供多種結(jié)果處理方式：

1. 直接讀取：顯示屏實(shí)時(shí)顯示吸光度或濃度。

2. 數(shù)據(jù)導(dǎo)出：通過USB或打印機(jī)輸出。

3. 軟件分析：進(jìn)行峰值分析、曲線擬合、酶學(xué)計(jì)算。

常用處理方法

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合：線性回歸計(jì)算R2，確保>0.99。

• 基線校正：扣除溶劑或空白對(duì)照值。

• 平滑處理：去除噪聲干擾，提高光譜清晰度。

六、注意事項(xiàng)

1. 樣品必須澄清透明，避免雜質(zhì)影響光路。

2. 比色皿方向統(tǒng)一，避免因光程差異帶來誤差。

3. 低濃度樣品需用窄帶寬、慢速掃描。

4. 酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)避免溫度波動(dòng)，建議結(jié)合恒溫系統(tǒng)。

5. 樣品濃度過高需稀釋，使吸光度落在0.1~1.0范圍。

七、優(yōu)化與進(jìn)階策略

1. 信噪比優(yōu)化
   選擇適合帶寬和掃描速度，重復(fù)測定取平均值。

2. 自動(dòng)化批量檢測
   與進(jìn)樣器配合，實(shí)現(xiàn)高通量分析。

3. 結(jié)果可追溯性
   保存原始數(shù)據(jù)文件，確保實(shí)驗(yàn)可重復(fù)驗(yàn)證。

4. 方法學(xué)驗(yàn)證
   對(duì)于關(guān)鍵檢測，需進(jìn)行精密度、線性范圍、檢出限等方法學(xué)評(píng)估。

八、總結(jié)

賽默飛BioMate 160分光光度計(jì)提供多種測量方法，涵蓋固定波長、多波長、光譜掃描、動(dòng)力學(xué)檢測、定量分析和透過率測量。正確的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與合理的參數(shù)設(shè)置，是獲得準(zhǔn)確可靠結(jié)果的關(guān)鍵。

在實(shí)際應(yīng)用中，BioMate 160能夠滿足核酸蛋白定量、酶活性分析、藥物成分檢測、食品安全檢測和環(huán)境監(jiān)測等多樣化需求。通過科學(xué)的操作流程和數(shù)據(jù)處理策略，研究人員不僅能獲得精確的數(shù)值結(jié)果，還能建立穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)方法，為科研和檢測提供堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)支持。