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QuantStudio 5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、SNP分型、病原檢測(cè)等領(lǐng)域。為確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，操作流程需嚴(yán)格執(zhí)行，涵蓋設(shè)備開機(jī)、反應(yīng)體系準(zhǔn)備、程序設(shè)定、運(yùn)行監(jiān)控及后期分析等完整步驟。
在開始實(shí)驗(yàn)前，用戶應(yīng)進(jìn)行以下檢查：
電源連接與主機(jī)狀態(tài)：確認(rèn)設(shè)備電源線連接良好，主機(jī)面板無(wú)異常指示燈。
樣品倉(cāng)清潔度：打開樣品艙蓋，確保反應(yīng)板架與樣品倉(cāng)無(wú)灰塵、無(wú)殘液污染。
通風(fēng)狀態(tài)：確保設(shè)備四周通風(fēng)良好，避免過(guò)熱影響溫控精度。
軟件環(huán)境檢查：確認(rèn)分析電腦已安裝QuantStudio Design and Analysis軟件，授權(quán)完整，版本符合實(shí)驗(yàn)需求。
建議使用正規(guī)認(rèn)證耗材，避免非匹配板、蓋或管導(dǎo)致數(shù)據(jù)誤差：
96孔熒光定量PCR板（光學(xué)透明底）
光學(xué)密封膜或?qū)Ｓ蒙w
微量移液器與濾芯槍頭
冰盒、PCR工作站或潔凈操作平臺(tái)
在開始配制之前，應(yīng)清晰確定以下參數(shù)：
目標(biāo)基因與引物序列
參考基因用于標(biāo)準(zhǔn)化Ct值
樣品組別與生物學(xué)重復(fù)次數(shù)
使用染料：SYBR Green 或 TaqMan 探針
是否需要熔解曲線分析
| 組分 | 體積（μL） |
|---|---|
| 2× Master Mix | 10.0 |
| 上游引物（10 μM） | 0.4 |
| 下游引物（10 μM） | 0.4 |
| 模板DNA/cDNA | 2.0 |
| 無(wú)RNA酶水（ddH?O） | 7.2 |
| 總計(jì) | 20.0 |
若使用探針?lè)?，?yīng)將探針（通常為10 μM）加入反應(yīng)體系中，同時(shí)調(diào)整ddH?O體積保持體系總體積恒定。
所有反應(yīng)組分應(yīng)在冰上操作，避免酶失活。
操作中盡量減少氣泡產(chǎn)生，氣泡會(huì)影響光學(xué)讀取信號(hào)。
建議配置1–2個(gè)無(wú)模板對(duì)照（NTC）以檢測(cè)污染。
將配置好的反應(yīng)液依序加入96孔板中，對(duì)照板架圖進(jìn)行排布記錄。
蓋上光學(xué)密封膜，確保密封緊密，避免蒸發(fā)。
輕輕離心（約1000 rpm，30 秒）以除去氣泡并使液體沉于孔底。
打開QuantStudio 5 儀器艙門，將96孔板準(zhǔn)確放入樣品托盤。
注意孔板方向，確保A1位置朝前左上角。
關(guān)閉艙門，準(zhǔn)備軟件設(shè)置。
啟動(dòng)QuantStudio軟件，點(diǎn)擊“新建實(shí)驗(yàn)”。
選擇實(shí)驗(yàn)類型：標(biāo)準(zhǔn)曲線法、相對(duì)定量、絕對(duì)定量、SNP檢測(cè)等。
命名項(xiàng)目并選擇相應(yīng)反應(yīng)板類型（96-Well Fast/Standard）。
根據(jù)所用染料和探針設(shè)定通道：
SYBR Green：常選FAM通道
TaqMan探針：依據(jù)熒光標(biāo)記物選擇（FAM、VIC、HEX等）
| 階段 | 溫度（℃） | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
|---|---|---|---|
| 初始變性 | 95 | 2分鐘 | 1 |
| 變性 | 95 | 15秒 | 40 |
| 退火/延伸 | 60 | 60秒 | |
| 熔解曲線 | 60–95 | 每步0.3℃ | 1 |
對(duì)于不同引物和酶體系，具體溫度和時(shí)間應(yīng)根據(jù)優(yōu)化結(jié)果設(shè)定。
在軟件中導(dǎo)入樣本信息或手動(dòng)填寫，包括樣本名稱、組別、目標(biāo)基因名、參考基因等。
勾選所需孔位對(duì)應(yīng)的檢測(cè)通道。
仔細(xì)復(fù)核實(shí)驗(yàn)設(shè)置與孔位標(biāo)注。
點(diǎn)擊“開始運(yùn)行”，設(shè)備將自動(dòng)執(zhí)行程序。
在實(shí)驗(yàn)運(yùn)行過(guò)程中，用戶可通過(guò)軟件實(shí)時(shí)查看以下信息：
熒光增長(zhǎng)曲線：評(píng)估PCR擴(kuò)增效率
儀器溫度狀態(tài)：監(jiān)控升降溫準(zhǔn)確性
擴(kuò)增圖譜預(yù)覽：識(shí)別異常曲線及時(shí)終止
一般情況下，整個(gè)PCR程序（含熔解曲線）耗時(shí)約1小時(shí)30分鐘至2小時(shí)。
完成擴(kuò)增后，軟件會(huì)生成.qpx實(shí)驗(yàn)文件，可導(dǎo)出為：
.xlsx（Excel）
.pdf（報(bào)告格式）
.csv（用于R/Python統(tǒng)計(jì)分析）
軟件自動(dòng)識(shí)別參考基因并歸一化Ct值
生成相對(duì)表達(dá)量柱狀圖或熱圖
可導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)誤、顯著性分析結(jié)果（需設(shè)定組別）
評(píng)估特異性擴(kuò)增情況
多峰提示非特異擴(kuò)增或引物二聚體
無(wú)模板對(duì)照應(yīng)無(wú)峰
輸入已知拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品Ct值，軟件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線
R2值用于評(píng)估線性相關(guān)性
斜率用于推算擴(kuò)增效率（理想值為–3.3，效率約100%）
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出96孔板，封存保存（如需保存擴(kuò)增產(chǎn)物）。
使用無(wú)塵布擦拭樣品艙及儀器外殼。
定期清潔樣本托盤與艙蓋內(nèi)側(cè)，避免污染積累。
定期檢查軟件更新，確保使用最新功能模塊。
建議將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同步至本地磁盤及云端雙重備份。
| 問(wèn)題 | 原因分析 | 建議解決方案 |
|---|---|---|
| 無(wú)擴(kuò)增曲線 | 引物設(shè)計(jì)問(wèn)題或反應(yīng)體系錯(cuò)誤 | 檢查引物序列、濃度、模板質(zhì)量 |
| 熔解曲線多峰 | 引物二聚體或非特異擴(kuò)增 | 重新設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化退火溫度 |
| Ct值偏差大 | 加樣誤差或板封不嚴(yán) | 使用多通道移液器并密封嚴(yán)密 |
| NTC出現(xiàn)擴(kuò)增 | 污染或熒光干擾 | 更換試劑，清潔工作區(qū)域 |
| 熒光信號(hào)過(guò)低 | 探針失活或染料降解 | 使用新探針或更換儲(chǔ)存條件 |
QuantStudio 5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀不僅在硬件穩(wěn)定性、光學(xué)靈敏度與數(shù)據(jù)處理能力方面表現(xiàn)優(yōu)異，其完整的軟件生態(tài)和用戶友好界面也極大提升了實(shí)驗(yàn)效率和數(shù)據(jù)質(zhì)量。掌握標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，是保證qPCR實(shí)驗(yàn)可靠性和可重復(fù)性的關(guān)鍵。
即便在使用二手設(shè)備的情境下，只要嚴(yán)格遵守操作流程、做好維護(hù)保養(yǎng)，依然可以獲得與新機(jī)相近的實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)和數(shù)據(jù)質(zhì)量。通過(guò)本文詳盡步驟指南，希望為各類分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室建立高質(zhì)量PCR平臺(tái)提供有力支持。
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