賽默飛 ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀操作指南

Applied Biosystems 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI 7500）是賽默飛（Thermo Fisher Scientific）推出的經(jīng)典實(shí)時(shí)PCR平臺(tái)之一，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、分子診斷、病原體檢測(cè)及基因定量分析等領(lǐng)域。該儀器具備高靈敏度檢測(cè)能力、穩(wěn)定的熱循環(huán)系統(tǒng)和成熟的軟件操作平臺(tái)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)核酸樣本的高效擴(kuò)增與實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)。

熟練掌握ABI 7500的操作流程，不僅有助于實(shí)驗(yàn)成功，也能確保數(shù)據(jù)質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。以下內(nèi)容將從設(shè)備準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)設(shè)置、反應(yīng)體系搭建、運(yùn)行過(guò)程、數(shù)據(jù)分析、常見(jiàn)問(wèn)題處理與儀器維護(hù)七大模塊系統(tǒng)介紹該儀器的使用方法。

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與設(shè)備啟動(dòng)

1. 環(huán)境準(zhǔn)備

• 確保儀器放置在干燥、無(wú)震動(dòng)的環(huán)境中；

• 環(huán)境溫度建議維持在18℃～25℃，濕度控制在60%以下；

• 避免直射光和強(qiáng)磁干擾；

• 儀器后方預(yù)留通風(fēng)空間不少于10厘米。

2. 儀器啟動(dòng)步驟

• 打開(kāi)主機(jī)電源，系統(tǒng)自檢開(kāi)始；

• 啟動(dòng)連接的計(jì)算機(jī)，打開(kāi)ABI 7500專(zhuān)用軟件；

• 軟件啟動(dòng)后，自動(dòng)連接儀器，顯示“Ready”狀態(tài)。

二、PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與反應(yīng)體系配置

1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)前需明確以下要素：

• 檢測(cè)目的（基因表達(dá)、絕對(duì)定量、病原檢測(cè)等）；

• 熒光方法（SYBR Green法或TaqMan探針?lè)ǎ?/p>

• 靶標(biāo)基因與參考基因序列；

• 引物及探針設(shè)計(jì)需考慮特異性、Tm值、二聚體風(fēng)險(xiǎn)；

• 實(shí)驗(yàn)設(shè)置包括樣本數(shù)、技術(shù)重復(fù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)組數(shù)等。

2. 反應(yīng)體系搭建（以20 μL體系為例）

注：ROX染料濃度根據(jù)使用的反應(yīng)體系調(diào)整為L(zhǎng)ow ROX或High ROX，具體根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)配置。

3. 反應(yīng)板準(zhǔn)備

• 使用專(zhuān)用光學(xué)96孔板或八聯(lián)排管；

• 用移液器準(zhǔn)確加樣，避免氣泡；

• 用光學(xué)膜封板，確保密封良好；

• 離心片刻，使液體集中在孔底。

三、軟件操作流程

ABI 7500軟件提供友好的人機(jī)交互界面，支持實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、運(yùn)行監(jiān)控與數(shù)據(jù)分析功能。

1. 創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)

• 打開(kāi)“7500 SDS Software”；

• 點(diǎn)擊“File” → “New Experiment”；

• 選擇實(shí)驗(yàn)類(lèi)型：Standard Curve、Relative Quantitation、Genotyping 等；

• 命名文件并保存。

2. 設(shè)置PCR反應(yīng)程序

• 默認(rèn)熱循環(huán)程序如下：

• 如為Fast模式，可將退火/延伸縮短至30秒；

• 反應(yīng)程序可自定義保存并復(fù)用。

3. 樣本信息錄入

• 切換至“Plate Setup”頁(yè)面；

• 錄入樣本名稱(chēng)、靶基因名稱(chēng)；

• 選擇每孔的檢測(cè)通道（FAM、VIC等）；

• 設(shè)置是否包含標(biāo)準(zhǔn)樣、陰性對(duì)照、參考基因等。

4. 啟動(dòng)運(yùn)行

• 確認(rèn)樣本板放入儀器；

• 點(diǎn)擊“Start Run”，儀器自動(dòng)執(zhí)行程序；

• 可實(shí)時(shí)查看熒光信號(hào)曲線(xiàn)，監(jiān)測(cè)擴(kuò)增情況。

四、數(shù)據(jù)分析與結(jié)果解讀

1. 實(shí)時(shí)曲線(xiàn)觀察

• 擴(kuò)增曲線(xiàn)應(yīng)呈“S”型；

• 曲線(xiàn)平滑、Ct值間隔一致，代表擴(kuò)增效率正常；

• 若觀察到多個(gè)平臺(tái)或抖動(dòng)，需排查試劑質(zhì)量或移液?jiǎn)栴}。

2. Ct值計(jì)算與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

• 軟件自動(dòng)識(shí)別基線(xiàn)與閾值，生成Ct值；

• 若使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法，可查看標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性關(guān)系與斜率；

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)效率理想值為90%～110%（斜率 -3.1至 -3.6）。

3. 相對(duì)定量分析

• 選擇參考基因與校準(zhǔn)樣本；

• 系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算ΔCt、ΔΔCt與表達(dá)倍數(shù)變化（2^–ΔΔCt）；

• 可視化柱狀圖輔助表達(dá)差異觀察。

4. 輸出與保存

• 結(jié)果可導(dǎo)出為Excel、CSV、PDF等格式；

• 可生成多圖合一實(shí)驗(yàn)報(bào)告，便于保存與發(fā)表。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1. 引物探針設(shè)計(jì)原則

• 引物長(zhǎng)度18-25 bp，Tm值在58-60℃；

• 避免重復(fù)序列、GC尾端或強(qiáng)互補(bǔ)序列；

• 探針應(yīng)設(shè)計(jì)在引物中間區(qū)域，防止與引物重疊。

2. 移液操作技巧

• 使用校準(zhǔn)移液器；

• 每次更換槍頭；

• 盡量避免產(chǎn)生氣泡；

• 同一批次樣品按固定順序加樣。

3. 板面密封與離心

• 使用原裝光學(xué)膠膜；

• 板面封膜后建議在3000 rpm下離心30秒；

• 防止揮發(fā)、氣泡或樣品不均影響擴(kuò)增曲線(xiàn)。

六、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方法

七、儀器維護(hù)與保養(yǎng)建議

• 每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，清理熱循環(huán)模塊，用無(wú)塵布擦拭殘留物；

• 每周檢查熱蓋壓力、散熱風(fēng)扇運(yùn)行是否正常；

• 每月進(jìn)行軟件備份、系統(tǒng)校準(zhǔn)確認(rèn)；

• 定期聯(lián)系廠(chǎng)家進(jìn)行年度光學(xué)系統(tǒng)校準(zhǔn)與維護(hù)；

• 避免重復(fù)使用老化的光學(xué)板或損壞耗材，確保熒光信號(hào)穩(wěn)定性。

八、結(jié)語(yǔ)

Applied Biosystems 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀作為一款經(jīng)典的qPCR平臺(tái)，憑借其成熟的系統(tǒng)構(gòu)架、穩(wěn)定的反應(yīng)條件和直觀的軟件設(shè)計(jì)，為生命科學(xué)與臨床檢測(cè)提供了高質(zhì)量的核酸定量解決方案。掌握其標(biāo)準(zhǔn)化操作流程與優(yōu)化策略，不僅可以提高實(shí)驗(yàn)效率，也能確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與可重復(fù)性。

對(duì)于科研人員而言，該設(shè)備是日?；虮磉_(dá)分析、病原檢測(cè)、SNP分析等工作的強(qiáng)大工具。而對(duì)于臨床實(shí)驗(yàn)室，它則是建立標(biāo)準(zhǔn)核酸檢測(cè)流程的重要平臺(tái)。通過(guò)科學(xué)管理與合理維護(hù)，ABI 7500將持續(xù)為實(shí)驗(yàn)室工作提供穩(wěn)定支持。